Abteilung Grünland und Futterbau/Ökologischer Landbau

Bakterien

Diversität denitrifizierender Bakterien im Grundwasser unter Böden mit unterschiedlicher landwirtschaftlicher Bewirtschaftungsintensität

von Christian G. Gliesche1, Gesche Braker2, Björn Schuster3 und Andreas Fesefeldt4

1, Institut für Ökologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Schwedenhagen 6; D-18565 Kloster / Insel Hiddensee

2, Center for Microbial Ecology, Michigan State University, East Lansing, MI 48824-1325, USA

3, Institut für Allgemeine Mikrobiologie, Am Botanischen Garten 1-9, D-24118 Kiel

4, Landeskriminalamt Schleswig-Holstein, Mühlenweg 166, D-24116 Kiel

1. Einleitung

Die biologische Bindung des elementaren Stickstoffs (Stickstofffixierung) und die Freisetzung von gebundenem Stickstoff aus Gewässern und Böden durch denitrifizierende Bakterien (Denitrifikation) gehören zu den wichtigsten Prozessen des Stickstoffkreislaufs. Sowohl die Stickstofffixierung als auch die Denitrifikation sind rein mikrobielle Prozesse und werden nur von bestimmten Bakteriengruppen durchgeführt, wobei die bakterielle Stickstoffbindung häufig in Symbiose mit Pflanzen abläuft. Bei der Denitrifikation wird Nitrat stufenweise über Nitrit zu den gasförmigen Produkten NO (Stickstoffoxid), N2O (Lachgas) und schließlich N2 (elementarer Stickstoff) reduziert.

Im Grundwasser unter den Grünlandflächen des Versuchshofes Karkendamm treten aufgrund der Bewirtschaftung unterschiedliche Mengen an Nitrat und Nitrit auf. Diese Stickstoffkomponenten beeinflussen zusammen mit der Konzentration organischer Kohlenstoffquellen die Zusammensetzung und Aktivität der bakteriellen Lebensgemeinschaften und hier besonders die der denitrifizierenden Bakterien. Es wurde geprüft, ob der Einfluß des unterschiedlichen Eintrages stickstoffhaltiger Verbindungen in das Grundwasser mit der Bewirtschaftungsform korreliert werden kann.

Die bakterielle Nitritreduktase (nirK- und nirS-Gen) katalysiert die Umsetzung von Nitrit zu NO und ist das Schlüsselenzym der Denitrifikation (dissimilatorische Nitratreduktion). Bei vielen denitrifizierenden Bakterien ist die Cytochrom cd1-enthaltende Nitritreduktase (nirS) zu finden. Manche denitrifizierende Bakterien (etwa 30%) besitzen hingegen eine kupferenthaltende Nitritreduktase (nirK). Die Gründe für diese unterschiedliche Verbreitung beider Enzyme bei gleicher Funktion sind bisher noch unbekannt.

Denitrifizierende Mikroorganismen finden sich in verschiedenen phylogenetischen Entwicklungslinien der Bacteria und Archaea. Hinzu kommt, daß innnerhalb einer Bakteriengattung oder –art einzelne Arten bzw. Stämme die Eigenschaft zur Denitrifikation besitzen können oder auch nicht. Deshalb sind molekularbiologische Nachweisverfahren, die auf dem Sequenzunterschied der Gene für die 16S bzw. 23S rRNA beruhen, für denitrifizierende Mikroorganismen nicht möglich.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Eignung spezifischer Fragmente der Gene für die kupferenthaltende Nitrit-Reduktase (nirK) und für die Cytochrom cd1-enthaltende Nitrit-Reduktase (nirS) zur Differenzierung und Identifizierung von denitrifizierenden Bakterien des Grundwassers unterhalb der Flächen mit unterschiedlicher Bewirtschaftungsform untersucht.

2. Material und Methoden

Die Probennahme (5-15 l Grundwasser) erfolgte alle 2 Wochen während des Zeitraums von Dezember 1997 bis April 1998 mit Hilfe einer Pumpe aus 2-3 m Tiefe. Die Gesamtzellzahl der Mikroorganismen am Standort wurde ermittelt (Bloem, 1995). Von ausgewählten Grundwasserproben wurden auf den Medien R2A-Agar (Merck, Darmstadt) und Grundwassermedium 1 (filtriertes Grundwasser [0,22 mm] mit 0,25 % Hefeextrakt]) die Lebendzellzahlen bestimmt. Die „most probable number“ (MPN) denitrifizierender Bakterien wurde in Grundwassermedium 1 mit 5 mM KNO3 bestimmt.

Die genetische Differenzierung der denitrifizierenden Bakterien erfolgte durch Amplifizierung von bestimmten Bereichen der beiden Gene für die Nitritreduktase (nirK- und nirS) mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion, die spezifisch für Denitrifikanten sind (Braker et al., 1998). Diese Genfragmente wurden dann kloniert (T-Cloning-Kit, MBI Fermentas) und anschließend sequenziert (ABI Prismä-System 373, PE Biosystems).

3. Ergebnisse und Diskussion

Die Gesamtzellzahlen, Lebendzellzahlen und „most probable number“ denitrifizierender Bakterien im Grundwasser unter den extensiv (Saugkerze Nr. 14) bzw. intensiv bewirtschafteten Flächen (Saugkerze Nr. 10) sind in Tabelle 1 aufgeführt. Im Grundwasser unterhalb der intensiv bewirtschafteten Fläche waren die Zellzahlen in fast allen Fällen geringfügig etwas höher.

Es zeigte sich, daß die denitrifizierenden Mikroorganismen der unterschiedlich bewirtschafteten Standorte in ihrer genetischen Struktur deutlich voneinander verschieden sind (Abb. 1 und 2). Die enge Clusterung der Organismen, die jeweils aus den Grundwasserleitern unter den intensiv bzw. extensiv bewirtschafteten Flächen isoliert wurden, unterstreicht die Stärke molekularbiologischer Methoden hinsichtlich der Charakterisierung kontaminierter oder nicht kontaminierter Grundwasserleiter.

Tabelle 1: Zellzahlen im Grundwasser unterhalb der unterschiedlich bewirtschafteten Flächen (Zellen/ml)

 

Grundwasser unter intensiver Fläche

Grundwasser unter extensiver Fläche

Gesamtzellzahl

6,6 x 106

4,8 x 106

Lebendzellzahl auf R2A-Agar

3,0 x 104

2,4 x 104

Lebendzellzahl auf Grundwassermedium 1

2,4 x 104

5,4 x 104

MPN denitrifizierender Bakterien

9 x 104

4 x 104

MPN, most probable number

 

4. Literatur

  • Bloem, J., 1995: Fluorescent staining of microbes for total direct counts. p. 4.1.8:1-12. In A. D. Akkermans, J. D. van Elsas, and F. J. de Brujn (ed.), Molecular microbial ecology manual. Kluver Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
  • Braker, G., A. Fesefeldt, and K.-P. Witzel, 1998: Development of primer systems for the amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 64, 3769-3775.

 


 

 Abb. 1. NEIGHBOR JOINING-Stammbaum, berechnet aus Nukleinsäure-Partialsequenzen des nirK-Gens denitrifizierender Bakterien. Das Dendrogramm zeigt die Verwandtschaft des nirK-Gens, erhalten nach Amplifikation aus Grundwasser-DNA zweier Grundwasserleiter im Vergleich mit bekannten nirK-Sequenzen. Die Grundwasserleiter befanden sich unterhalb einer intensiv (Klone mit ”intensiv” bezeichnet) bzw. einer extensiv bewirtschafteten Fläche (Klone mit ”extensiv” bezeichnet) im Versuchsbetrieb Karkendamm der Universität Kiel in Schleswig-Holstein. Die Berechnung erfolgte mit den Programmen DNADIST sowie NEIGHBOR JOINING aus PHYLIP 3.5c. Der Abstandsbalken zeigt 10% Sequenzunterschied zwischen jeweils 2 Nukleinsäuresequenzen an.

 

Abb. 2. NEIGHBOR JOINING-Stammbaum, berechnet aus Nukleinsäure-Partialsequenzen des nirS-Gens denitrifizierender Bakterien. Das Dendrogramm zeigt die Verwandtschaft des nirS-Gens, erhalten nach Amplifikation aus Grundwasser-DNA zweier Grundwasserleiter im Vergleich mit bekannten nirS-Sequenzen. Die Grundwasserleiter befanden sich unterhalb einer intensiv (Klone mit ”intensiv” bezeichnet) bzw. einer extensiv bewirtschafteten Fläche (Klone mit ”extensiv” bezeichnet) im Versuchsbetrieb Karkendamm der Universität Kiel in Schleswig-Holstein. Die Berechnung erfolgte mit den Programmen DNADIST sowie NEIGHBOR JOINING aus PHYLIP 3.5c. Der Abstandsbalken zeigt 10% Sequenzunterschied zwischen jeweils 2 Nukleinsäuresequenzen an.

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